RT-PCR根据什么序列设计引物

Question

是根据cDNA序列设计引物吗？要不要加上3‘UTR的序列？
谢谢！

Answer 1

根据CCDS区设计，可以设计跨内含子或不跨内含子，从3‘端开始寻找适合的下游引物，然后往上寻找适合的上游引物，扩增片段大概150~200bp追问

是cds序列吗？和cdna序列不一样啊

Answer 2

根据cDNA序列设计就行了，不用加3‘utr，你做载体构建还是tr-pcr基因检测？追问

做rt-pcr检测。我们老板说要加上3‘utr的序列，不知道为什么？

追答

不用加，我做rt-pcr检测那么多了，从来没有加过，你测什么基因啊，啥物种的啊，只要保证你设计的引物中有一条跨两个外显子就行了，这样可以保证特异性，避免检测到基因组DNA

追问

我做的是甜橙基因。跨越两个外显子是什么意思啊？具体怎么操作啊。cDNA序列本身不久含有5‘和3‘UTR吗？

追答

因为基因组DNA序列外显子中间是隔着内含子的，你根据CNDA序列设计引物的时候，打个比方，假设序列中有5个外显子，你可以让上游引物或者下游引物的碱基的前半截位于其中的第一个外显子上，后半截位于第二个外显子上，这样就是跨两个外显子了

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