想请教一个PCR基本问题。 PCR时，目标基因的核苷酸序列是未知的，那我们设计引物是根据其近缘种的基因设计

Question

PCR时，目标基因的核苷酸序列是未知的，那我们设计引物是根据其近缘种的基因设计吗？
我分离得到一个蛋白，想进行表达，首先要获得其全长基因。提取RNA,要进行一步法RT-PCR，这时需要基因特异性引物，是不是在gene bank 里由其近缘种的保守序列进行设计？这样获得的是目的蛋白的全长基因吗？

Answer 1

可以根据其其近缘种的保守基因序列设计，但通常都很难得到全长。要得到基因全长，可先得到中间片段序列，然后RACE或者Inverse PCR都可以尝试下。如果近缘种序列同源性很高，还可以参考其他物种序列，设计几对引物，直接扩增基因全长。

Answer 2

引物一和引物二以及互补序列都可以用DNA合成仪合成，把引物一和引物二的互补序列分别连接到目标基因的两条链上。PCR结束再用限制酶把引物部分切除。追问

你说的是RACE吧？
我想知道
PCR时，目标基因的核苷酸序列是未知的，那我们设计引物是根据其近缘种的基因设计吗？

追答

引物及其互补序列不属于目的基因。
现在中学都会有硕士研究生，我们学校就有一位在南师大读研期间研究基因工程，我也是请教她。如果您是和我一样的老教师，可以请教他们，如果您是读研，咨询您的老板。

Answer 3

PCR的条件是已知目的基因的核苷酸序列 不知道目的基因的序列怎么添加引物啊？

Answer 4

可以通过蛋白质测序得到蛋白的一级结构即氨基酸序列，然后去database中blast到同源性最高的蛋白，可以根据这个蛋白的基因设计引物

Answer 5

不一定可以得到全长的基因，如果要得到全长的，可以用RACE技术来的到全长。