RT-PCR中逆转录后，PCR步骤的引物设计

Question

你好，我想请问，我在Genbank里面搜索到了目的基因序列的mRNA序列，这段序列没有克隆出cDNA.我想做RT-PCR。PCR步骤里面，自己用Prime Primer 设计引物，怎么设计呢？是用搜索到得mRNA,还是要用cDNA的序列呀？

Answer 1

都一样，只不过mRNA上的U到cDNA换为T。一般引物软件都是自动识别。所以不用担心。追问

还想再请教：我开始SEARH以后，根据Rating选择了引物对，在False priming 上显示了红色的Found,然后点开查看具体错配的情况，这时候窗口会显示错配的具体情况，里面不是显示有G值吗？除此以外还有一个product=0,有时候则是product=一个自然数比如332，1045等等，这是什么意思呢？我该怎么选择呢？
还有在oligo里面也是，存在priming efficiency，这个效率选多少为好呢？

追答

我出来没有用过你说的这个软件。所以那个设置参数无法给你解答了
我一般都用Vector NTI，或者免费的Primer 3.
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi 强烈推荐。我们这里很多发表的文章都引用的这个。

,有时候则是product=一个自然数比如332，1045等等，这是什么意思呢？
-----这个一般都是指引物的位置。

最后我想提醒你的是，看起来你的目的是要克隆全序列？建议先用RACE-PCR得到两端的序列，然后根据RACE-PCR的测序结果，设计引物来克隆。
还有可能就是现在的引物序列没有错误，但是由于你PCR或者样本的条件不好，所以没有得到产物。

本回答被网友采纳

Answer 2

网上有Primer 5.0的设计视频，可以学习一下。我觉得应该是可以直接用mRNA的序列，在prime primer 中能自动转换成互补的序列，然后再进行引物设计。

Answer 3

你最好能找到该序列的完整序列，再根据你感兴趣的部分进行引物设计。再设计之前最好对序列先进行翻译，看看你想要的那段是不是表达。