荧光定量PCR引物为什么要跨内含子设计

Question

如题所述

Answer 1

避免基因组dna的影响。
荧光定量pcr的扩增区段比较小，也就200bp左右，而且一般以cdna为模板。如果不注意引物设计的话，很可能落在同一个外显子内。此时，无论cdna还是基因组dna都会给出同样的信号，也就是说定量会出现误差。如果引物跨内含子，则cdna会给出信号，而基因组dna由于引物无法完全配对而没有信号，也就避免了基因组dna的影响。

Answer 2

引物若跨内含子的话，引物仅能以3'端的一小部分结合基因组DNA，这样的话Tm会很低。在较高的退火温度下，引物几乎无法和基因组DNA结合来引发聚合，而主要是与能够完全配对的cDNA结合并引发反应。