【求助】Real-time PCR 引物设计求助

Question

各位前辈帮帮忙：通常real-time PCR的引物要分别在两个外显子上，但我要研究的target gene 只有一个内含子，而且如果非要PCR产物跨过内含子的话所得出引物特别不好，不是有严重的错配就是有dimer or cross dimer，得到的最好的一对primer如下： sense:5'GTCTTTCGGATTTCGC Tm 47.9 ， GC 50 ， length 16 ，none(hairpin, dimer, false priming, cross dimer )anti-sense:5'TCGAGGATTTCAACACTGT Tm 47.2 ， GC 42.1 ，length19， found dimer(自由能-7.3) none othersproducts size：209我觉得这对引物的Tm值过低，产物又过长，请问各位前辈，这对引物能用于定量PCR中吗？如果我们设计的引物在一个外显子上对定量的影响有多大？有什么办法可以减小引物在一个外显子上对定量的影响？

Answer 1

博凌科为-为你解答：1.跨越内含子主要为了避免抽提、反转录过程中残留基因组DNA污染的干扰，因为基因组DNA是不会存在两个外显子连续这样一段序列的，如果引物只在一个外显子上就要冒这种风险2.个人感觉引物能不能工作，上下游引物的Tm值要接近，这个最重要，至于别的发卡，茎环等就要看运气了，不行的话就再试几个，实在不行就用老外文献上的引物好了，记得注明参考文献就行了。good luck

Answer 2

你引物的参数确实有问题。
如果引物设计困难，结果不理想。重新设计在一个外显子上也没有不可，不过在提取RNA的时候要加一步DNA酶消化。如果你用的是QIAGEN的试剂盒，就按照里面的原柱DNA酶消化就可以了。不一定非要纠结于外显子-内含子交界区。
我这样做过很多，完全不用担心的。