求助，race引物怎么设计呢？已知序列

Question

cds已知，怀疑是两边utr序列不对。已有cds的中间一段序列。
设计两边的race引物。5‘和3’都要做。5‘端设计下游引物，3’端设计上游引物。一个引物怎么设计呢？
但是对race设计引物不是很明白。用pp5设计的时候直接在search里面选择 sense primer 和A sense primer 还是选择both 最后只取需要的正义和反义？
怎么知道race结果的大小呢？设计几对巢式引物。。。。但是试剂盒里只有inner outer引物。。请指教！呜呜呜，老师不理，只能自己琢磨。

Answer 1

看来你对RACE的原理还不太清楚。试剂盒只是提供5`和3`的延伸序列，以及针对的outer和inter引物。因为末端序列未知，加上延伸序列后，就有了已知序列，作为PCR引物的基础。你要做的就是，把延伸序列加到你已知的CDS上（第一个外显子），未知序列用N代替。这样，任何一个引物设计软件都可。设计的时候5`和3`分开设计。一端是指定引物，由试剂盒提供，软件自动寻找符合条件的引物。所以你引物设计的条件也要预先设好，软件默认的设置不一定好用。
至于产物大小，完全是靠估计的，毕竟UTR可长可短，所以PCR的延伸时间一开始都放长一些。