包涵体变复性包涵体变性

Question

如题所述

Answer 1

在包涵体变复性过程中，首先通过破菌基因工程菌发酵液离心浓缩，处理方法多样，包括机械破碎和超声破碎。超声破碎在菌量较少时效果较好，但大体积悬液中能量传递和局部产热问题导致其应用受限，可能导致未破碎细胞与包涵体混杂。因此，大规模纯化时，一般采用溶菌酶先破碎细胞膜，再结合超声破碎，以提高包涵体纯度和回收率。

化学方法如裂解细菌后，通过离心分离出包涵体，5000-20000g离心15分钟有助于大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。洗涤阶段至关重要，需用低浓度的变性剂去除杂质，如膜蛋白或核酸。过高浓度的尿素或盐酸胍可能导致包涵体溶解，适宜的洗涤条件为2M尿素在pH 7.0-8.5的Tris缓冲液和1mM EDTA中。温和的去垢剂如TritonX-100则用于去除膜碎片和蛋白。

溶解包涵体通常使用强变性剂，如尿素（6-8M）或盐酸胍（6M GdnHCl），它们能打断蛋白质分子间的化学键，使多肽伸展。盐酸胍优于尿素，能溶解尿素难以处理的包涵体。去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等也能破坏蛋白疏水键。对于含半胱氨酸的蛋白质，可能需要还原剂如巯基乙醇、DTT等，以还原链间的二硫键，浓度一般在50-100mM，有时粗放条件下可降低至5ml/l。还原剂的选择和使用取决于目标蛋白的特性以及是否存在杂蛋白影响。