已知一个基因的mRNA和cDNA，我想克隆此基因，进行转染表达，但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求！

Question

我目的片段大小为2800，载体为eGFP-N1，设计引物中，我是取了ATG开始的前20个左右的碱基，加入酶切位点和保护碱基，后面是取了去掉终止密码子的互补序列，加入酶切位点和保护碱基……（问题：1、除了酶切位点和保护碱基，还有什么需加入什么吗？2、需要在上游序列中加入KOZAK序列吗？其作用是什么？下游也需要吗？3、酶切位点的保护碱基是特定的吗？4、克隆目的基因，必须从ATG开始设计上游引物，终止密码子设计下游引物吗？可不可以从中间或者两侧设计？因为位置若固定的话很难找到合适的引物）……十分紧急，万分感谢！！！

Answer 1

1.首先这应该是个融合表达载体。应该考虑后面的读码框问题。就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基。使得你的目的基因和egfp在同一读码框内。
2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用，这就看你后期的实验目的了。不过不加的话应该只是效果没有加了好，而不是没有效果。下游当然不用加。
3.NEB公司的网站上有特定酶的保护碱基图表。他们应该都是进行过研讨的，所以建议您参考这个。
4.克隆目的基因当然要保证从ATG开始。到终止码结束。这样叫一个完整的CDS区，表达一个完整的功能蛋白。不可以小于这个范围，但是多出来也许可以吧。就是从两侧的UTR区开始设计。但是我不敢保证啊。所以我建议您先在UTR区设计引物，扩出来长片段后再扩增您的目的片段。这样会容易点。
P.S.保护碱基的作用是可以使PCR产物两端的酶切位点被识别，从而可以直接酶切PCR产物使其产生粘性末端，以便进行后续的克隆。这和PCR能否扩增出来没有任何关系。

Answer 2

⊙﹏⊙b汗
严重怀疑你是东西加多了
注意一下引物的长度,突变,二聚体这些因素.....而且网上有好多设计引物的网站啊,都是免费的.用下载的Primer Premier也行啊...度能设计出很好的引物
不行你就用高保真酶试试
实话告诉你,上次我们实验室设计个引物连保护碱基都没加,一样P出来了

另外你注意一下PCR过程中的问题,比如反应体系优化啊,盖子盖没盖严啊,退货温度之类的