coip实验原理

Question

如题所述

Answer 1

coip实验原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。

免疫共沉淀，是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

细胞裂解后，孵育结合了抗体的珠子，诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上，同时诱饵蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，便得到免疫共沉淀产物，产物既可用WesternBlot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定未知蛋白。

在免疫共沉淀实验中没有检测到目的蛋白：

1、样品中目的蛋白未表达或者表达量低。这种情况下建议确定目的蛋白的蛋白谱，确定它会表达。

2、可以适当增加裂解液，但要注意后续要将裂解液去除干净。

3、抗体使用量少，没有足够的抗体去捕获目的蛋白。建议增加抗体的使用量。

4、缓冲液、洗脱液的pH可能不能将目的蛋白洗脱。建议根据想要洗脱的蛋白质，调整溶液正确的二pH值。

5、抗体没有与免疫吸附磁珠结合。注意查看磁珠与抗体亚型是否匹配。

理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。