基因芯片 原位合成与点样的区别

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Answer 1

----------------------DNA芯片技术与SNP分析--------------------------
摘要: 基因芯片技术作为一种新兴的生物技术,近年来得到迅速发展,其应用具有巨大的潜力。单核苷酸多态性(SNP) 作为新的遗传标记对基因定位及相关疾病研究的意义亦非常重大。本文主要介绍了DNA 芯片技术的原理和分类、单核苷酸多态性检测方法及DNA 芯片技术在单核苷酸多态性检测方面的应用。
生物芯片技术是90 年代初发展起来的,集分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术和计算机科学等于一身的一门新型技术。目前发展的生物芯片种类繁多, 如蛋白质芯片、基因芯片、激素芯片、药物芯片等。但最初的生物芯片主要用于对DNA 的测序, 基因表达谱的鉴定及基因突变体的检测、分析等方面[1 ] 。迄今为止, 使用最多的也是DNA 芯片。DNA 水平遗传多态性标记至今已经历了3 个阶段:限制性酶切片段长度多态性标记(RFLP) 、DNA 重复序列的多态性标记(包括小卫星、微卫星DNA 重复序列) 、单核苷酸多态性标记( single nucleotide polymorphisms , SNPs) [2 ] 。
SNP 具有数量多,分布广泛,易于快速、规模化筛查,便于基因分型等特点。伴随着SNP 检测和分析技术的进一步发展,尤其是与DNA 芯片等技术的结合, SNPs 在基因定位中具有巨大优势和潜力, 并为DNA芯片应用于遗传作图提供了基础。由于基因芯片具有携带信息量大和检测方便的特点,使得用DNA 芯片对SNP 进行分析具有广阔的前景。DNA 芯片和SNP 分析已日益成为研究功能基因组学的工具。
1 基因芯片
基因芯片的基本原理是应用已知的核苷酸序列作为探针与标记的靶核苷酸序列进行杂交,通过对信号的检测进行定性与定量分析。基因芯片可在一微小的基片(硅片、玻片等) 表面集成大量的分子识别探针,能够在同一时间内平行分析大量基因,进行大信息量的检测分析[3 ] 。基因芯片应用很广, 根据所用探针类型不同分为cDNA 微阵列(或cDNA微阵列芯片) 和寡核苷酸阵列(或芯片) ,根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片(toxchip) 、病毒检测芯片(如肝炎病毒检测芯片) 、p53 基因检测芯片等。根据其作用可分为检测基因质和量的芯片。量的检测包括:检测mRNA 水平、病原体的有无及比较基因组基因的拷贝数,既可用寡核苷酸芯片,又可用cDNA 芯片完成,但cDNA 芯片更具优势。质的检测包括:DNA 测序及再测序、基因突变和SNP 检测等,主要用寡核苷酸芯片完成。
2 SNP
单核苷酸多态性(SNP) 是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2 :1。SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106 个[4 ] 。
绝大多数疾病的发生与环境因素和遗传因素的综合作用有关,通常认为是在个体具有遗传易感性的基础上,环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状(如对药物的反应性等) 有差别,其遗传学基础是人类基因组DNA 序列的变异性, 其中最常见的是SNP。易感基因的特点是基因的变异本身并不直接导致疾病的发生,而只造成机体患病的潜在危险性增加,一旦外界有害因素介入, 即可导致疾病发生。另外在药物治疗中,易感基因的变异造成药物对机体的疗效和副作用不同。
随着人类基因组计划的进展,人们愈来愈相信基因组中的SNP 有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此, 寻找和研究SNP 已成为人类基因组计划的内容和目标之一[5、6 ] 。
3 SNP 的检测方法
SNP 的分型技术可分为两个时代,一为凝胶时代,二为高通量时代。凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP) 、寡核苷酸连接分析(OLA) 、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS2PCR) 、单链构象多态性分析(SSCP) 、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE) ,虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样,但是由于它不能进行自动化,只能进行小规模的SNP 分型测试,所以必然会被淘汰。高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交(ASH) 、特异位点引物延伸(ASPE) 、单碱基延伸(SBCE) 、特异位点切割(ASC) 和特异位点连接(ASL) 5 种方法。此外,采用特殊的质谱法[7 ] 和高效液相层析法也可以大规模、快速检出SNP 或进行SNP 的初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成,直接合成高密度的可控序列寡核苷酸,使DNA 芯片法显示出强大威力,对SNP 的检测可以自动化、批量化[8 ] ,并已在建立SNP 图谱方面投入实际应用。DNA 芯片法有望在片刻之间评价整个人类基因组[9 ] 。
4 基因芯片在SNP 分析方面的应用
4.1 疾病预防
随着人类基因组计划的逐步发展,人们分析出了许多基因序列,下一步是要分析这些基因的多态性与生物功能和疾病的关系。通过基因芯片检测SNP ,可以确定基因多态性和疾病的关系;在预防医学方面,可使人们尽早地认识自身潜在的疾病,并实施有效的防治措施,从而做到疾病的早期预防。1997年美国提出了环境基因组学计划,目的是要了解环境因素对人类疾病的影响和意义,针对与环境因素发生相互作用的蛋白的编码基因(如DNA 修复机制、氧化2还原反应及病毒受体蛋白等) 来识别其基因组的多样性以及其结构2功能的关系,从而发现与特定环境因子相关的危险人群,制定出相应的具有个体化特点的危险度评价和预防措施。SNP 是在漫长的进化过程中形成的,具有遗传稳定性。
将其与基因芯片技术相结合进行基因分型, 将会产生大量的遗传易感性标志物,使通过基因分析来筛选易感个体、重点保护高危人群成为可能。美研究人员采用高通量微阵列基因分析方法, 对美国15 个医学中心的352 例患冠状动脉疾病者和418 名未患该疾病个体的62个基因进行了评估[10 ] 。在编码血小板凝血酶敏感蛋白的基因上,鉴定出3 种SNPs (TSP-1 ,TSP-2 ,TSP-4) ,携带TSP-4 (杂合子或纯合子) 变异体的个体患心肌梗塞的危险性高达89 %以上; 携带的TSP-2 变异体为纯合子者发生心肌梗塞的危险性大为降低; 携带的TSP21 变异体为杂合子者冠状动脉疾病过早发生的危险性增加9 倍以上。这种可预示危险性增加的遗传学证据的发现对疾病预防来说是一种进步,这些变异体可能成为预测心血管疾病发生的指标之一。
4.2 临床诊断和个性化治疗
利用基因芯片技术对人类未来疾病作出诊断,具有广阔的前景。Wang 等[11 ] 应用高密度基因芯片对213Mb 人类基因的SNP 进行筛查,确定了3241 个SNPs 位点,显示出大规模鉴定人类基因型的可能。同样,利用基因芯片技术分析感染病毒、细菌基因的多态性,有助于人们了解病毒、细菌的感染发病机制与抗药性机制。例如利用基因芯片检测结核菌核糖体16sRNA 的多态性,可了解结核菌对雷米封和异烟肼的耐药情况。Kozal 等[12 ] 用高密度HIV 寡核苷酸探针芯片对HIV 病株的多态性进行了分析, 观察到HIV21 包膜氨基酸的天然多变性, 对病人临床用药及预后具有重要意义。Kozal等[13 ] 利用芯片技术,对尚未使用蛋白酶抑制剂的HIV 感染病人的HIV21 蛋白酶基因多态性进行研究,并将结果与传统法测序结果相比较,在114 例病人样本中,两者吻合率达98 %。
4.3 药物开发与合理用药
目前兴起的药物基因组学(pharmacogenomics) 主要研究遗传因素对药物作用的影响和不同基因型个体对药物反应的差异[14 ] , 从而为临床有针对性地合理用药和根据不同基因型群体对药物的反应来改进药物设计提供了理论依据。而SNP 是药物基因组学的分子基础[15 ] ,这是当前制药行业对SNPs 制图和发展大量检出SNPs 方法表现出空前兴趣的原因。例如,影响药物体内效应的一个重要因素是肝脏的代谢酶系统,而造成酶功能差异的则是决定其结构及功能的DNA 序列。如果将与药物代谢有关的主要酶系统的DNA 制成基因芯片,便可迅速确定病人之间肝代谢酶的遗传学差异。
近来很多基因分析技术已应用于遗传药理学研究,但如果要同时快速分析多个病人的多个基因以确定其用药方案,则利用基因芯片技术筛选出相关SNP 是最佳选择[16 ] 。
5 前景和展望
基因芯片的一个重要发展趋势是芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化,提高基因芯片的准确性和可靠性。从今后大量的基因多态性检测的应用需求,以及基因芯片的标准化和批量化生产角度来看,利用高分辨率在片合成技术制备高密度基因芯片是一个重要的发展趋势[17 ] 。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异,可以大大提高芯片的准确性和检测范围,把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记,并使它们同时与基因芯片杂交,通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱[18 ,19 ] 。例如用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列, 使它们同时与芯片杂交,通过不同荧光强弱的比较得出靶序列中碱基失配的信息[20 ] 。
迄今能揭示多基因改变与一些疾病如心脏疾患、糖尿病、哮喘及精神分裂等易感性联系的,非SNPs 莫属。使用基因芯片进行SNP分析,具有快速、高效、准确、可产业化等特点,虽然它还处在初始阶段,但已显示出潜在的广阔的应用前景。

参考资料：国外医学卫生学分册2004年第31卷第1期

Answer 2

“微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌 ”。

一、生物芯片与基因芯片
生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。鉴于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。
目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”,也被称为基因芯片(Gene chip)DNA芯片(DNA chip)。按照载体上点的DNA种类的不同，基因芯片可分为寡核苷酸和cDNA两种芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等等。早在八十年代初期,Bains等人就用杂交的方法对固定在支持物上的短DNA片段进行序列测定。基因芯片技术从实验阶段走向工业化是得益于其他技术的引入，如激光共聚焦显微技术、探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术的结合和双色荧光探针杂交系统的建立。90年代初期人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）和分子生物学相关学科的发展也为基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。

二、制备基因芯片的必要条件
1、靶基因 用于芯片点样的是靶基因。靶基因可分为染色体DNA（或基因组DNA）、cDNA（或人工合成DNA）。目前，以cDNA的研究为主，因为cDNA是染色体上编码蛋白质的DNA序列，有医疗和其他领域的研究价值和商业价值。
2、制备技术 基因芯片的制备综合了生命科学、化学染料、微电子技术、激光、统计学等领域的前沿技术，主要包括芯片的制备（选择点样仪和玻片、靶基因的扩增和固定）、杂交探针的制备（mRNA的抽提、mRNA的逆转录、PCR和探针荧光标记）、杂交条件的优化技术（杂交液、杂交条件和洗涤条件的选择）和数据分析技术。其中，基因芯片的制备主要依赖于微细加工（microfabrication）、自动化（automatism）及化学合成技术。通常比较典型的DNA芯片制备方法有3种：（1）原位合成法（in situ synthesis） 以Affymetrix公司开发的光引导原位合成法为代表（2）合成点样法 又根据是否与芯片的表面接触分为化学喷射法和接触式点涂法，分别以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大学为代表（3）压电法 通过使用4支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位DNA探针合成。

三、基因芯片技术简介
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。
1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。
4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

四、基因芯片的应用及其商业价值
目前，基因芯片技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。另外基因芯片在农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将作出重大贡献。 基因芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视。
鉴于基因芯片的巨大潜力和诱人的前景，基因芯片已成为各国学术界和工业界研究和开发的热点。尤其在美国，正处于人类基因组计划以来的第二次浪潮之中，美国总统克林顿在1998年1月的国情咨文中指出：“在未来的12年内，基因芯片将为我们一生的疾病预防指点迷津”。1998年6月29日美国宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入，以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起，目前美国已有8家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75％，专家今统计：全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。美国财富杂志载文：在20世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。鉴于生物芯片技术具有巨大理论意义和实际价值，基因芯片研究在国内也有了很快的发展，例如，复旦大学、中科院上海冶金所、清华大学、联合基因有限公司、军事医学科学院、中科院上海细胞所等单位已在生物芯片技术方面取得了较大突破，相信不久将有我国生产的生物芯片产品投放市场。
总之，以基因芯片为代表的生物芯片技术的深入研究和广泛应用，将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响

Answer 3

基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
原位合成是一种制作基因芯片的方法，是原来用于电子芯片制作的光刻法转为核酸序列的合成技术。利用光罩控制反应位置，将核苷酸分子依序列一个一个接上去；可大量生产超高密度的芯片。由于制程与光罩成本等因素，这种方法做出的探针长度约在25-mer以下；因此同一个基因需要多个探针对应，以避免误判。

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参考资料：http://baike.baidu.com/view/23110.htm http://baike.baidu.com/view/898018.htm

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