miRNA引物设计(茎环法+染料法检测)
设计方法:通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物,正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列,反向引物在茎环上。
反转录茎环通用序列:
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC
miRNA序列:
>mmu-miR-99b-5p
MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG
mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为:
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG
定量PCR反向引物为:TGTCGTGGAGTCGGC
正向引物为:CACCCGTAGAACCGAC
备注:
1
定量PCR反向引物和正向引物的TM值不要相差太大,反向引物TM已经确定,如果正向引物TM较低,则在5`端添加几个碱基(如:G)。
2
染料法的检测可能会出现引物二聚体和非特异性扩增,可以使用探针法检测,探针法和染料法相似,只是茎环上不仅有一个反向引物结合位点,还有一个探针结合位点。