怎样提取粪便DNA

如题所述

提取粪便DNA可以直接用粪便DNA提取试剂盒,使用步骤:

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机
在室温下离心。

1、称取粪便样本 0.1-0.5g,在液氮中充分研磨成细粉末,加入 450ul 溶液 A 震荡混匀。
* 也可直接称取样本 0.1-0.5g 于离心管(建议使用 2ml 圆底管),加入 450ul 溶液 A 剧烈震荡混匀
1-2min 至没有固体块。 使用液氮研磨效果最佳。 

2、加入 50ul 溶液 B 充分颠倒混匀( 不要剧烈震荡),65℃水浴 6min,每 2min 充分颠倒混匀一次。

3、加入 100ul 溶液 C 充分颠倒混匀( 不要剧烈震荡),12000 rpm 离心 10min 。

4、将上清转移到新的离心管,12000rpm 离心 2min 。

5、在吸附柱中加入 200ul 溶液 D ,将离心后的上清加入到带有溶液 D 的吸附柱中,用移液器吹吸几次混
匀,12000 rpm 离心 1min。

6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱( 必须),12000 rpm 离心 1min。 

7、倒掉收集管中的废液,在吸附柱中加入漂洗液 500ul,12000 rpm 离心 1min。

8、倒掉收集管中的废液,重复步骤 7 两次(共漂洗三次)。 

9、倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管,12000 rpm 离心 2min 。 

10、拿出吸附柱在室温干燥数分钟( 因季节及气候等因素不等),或 50℃干燥 1min。

11、将吸附柱放入一个新的离心管中,加入 50-100ul 洗脱液(65 ℃预热),12000 rpm 离心 1min。
12、将离心管中的液体重新加入到吸附柱中,12000 rpm 离心 1min。离心管中即为粪便微生物 DNA 溶液。

注意事项:

1、新鲜的粪便样本会得到更高的产率,不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。 

2、若溶液中出现浑浊可在 37℃水浴中溶解片刻至清澈,不会影响结果。 

3、在需要吸取上清液的步骤中应避免吸到沉淀,否则会堵塞吸附柱,并影响产物纯度。

4、洗脱缓冲液的体积最好不少于 50ul ,体积过小会影响回收效率;建议使用试剂盒附带的洗脱缓冲液,
用水洗脱也会损失部分产物;DNA 应保存在-20 ℃避免反复冻融,以防降解。 

5、 液体试剂避免接触皮肤,若意外接触应立即使用大量清水冲洗。

温馨提示:答案为网友推荐,仅供参考
第1个回答  2021-04-13
如下是粪便手动提取方法,推荐使用武汉纳磁试剂盒上机自动提取更加方便,节省70%繁杂操作。

1、 固态粪便提取:称取0.1 g粪便样本转移至一个干净的离心管,向离心管加入450 μL裂解液,5 μL蛋白酶K,0.1 g氧化锆(可选用,能提高革兰氏阳性菌研磨破壁率),充分混匀30 S-60 S(非常重要),70℃金属浴裂解10 min,中间混匀一次。
液态粪便提取:若为保存液粪便,且保存液较澄清,充分混匀悬浮后,取500 μL悬液,直接12000 rpm离心1 min,取上清200 μL,加入450 μL裂解液,5 μL蛋白酶K,70℃金属浴裂解10 min。
粘稠液态粪便:使用保存液按照900 μL~1200 μL保存液/1g粪便的比例混合重悬,12000 rpm离心1 min,取200 μL上清。加入450 μL裂解液,5 μL蛋白酶K,70℃金属浴裂解10 min。
土壤提取:称取0.25-0.3 g土壤转移至离心管,向离心管加入450 μL裂解液,5 μL蛋白酶K,0.1 g氧化锆,充分混匀30S-60S(非常重要),70℃金属浴裂解10 min,中间混匀一次。
2、 (尽量避免取到上层油状物,液态粪便可省去此步操作)裂解结束,12000 rpm离心2min,取400 μL上清液到新的1.5 mL或2.0 mL离心管中。。
3、 向离心管加入150 μL除杂剂,充分混匀,4℃冰浴5 min。
4、 取400 μL 磁珠至 1.5 mL或2.0 mL离心管中(注意:为了确保磁珠彻底重悬,请充分振荡混匀后立即吸取),置于磁力架上静置 1 min 后将全部上清吸出,磁珠保存待用
5、 冰浴结束后,将离心管12000 rpm 离心2 min,取400 μL上层清液,至磁珠保存待用的离心管中。
6、 向离心管中加入500 μL结合液,振荡混匀1 min,室温静置10 min,每3 min混匀一次。
7、 将离心管置于磁力架上,静置1 min,期间颠倒磁力架5~6次,使管盖上的磁珠被磁力架吸附,用移液器吸去管盖和管中的液体。
8、 取下离心管,加入500 μL洗涤液Ⅰ,将离心管充分振荡混匀2 min后,期间颠倒磁力架5~6次,使管盖上的磁珠被磁力架吸附,置于磁力架上,静置30 s,磁珠完全吸附后,吸弃上清。
9、 取下离心管,加入600 μL洗涤液II,将离心管充分振荡混匀2 min后,期间颠倒磁力架5~6次,使管盖上的磁珠被磁力架吸附,置于磁力架上,静置30 s,磁珠完全吸附后,吸弃上清。
10、 重复步骤9。
11、 步骤10吸弃上清后,打开管盖,室温干燥2 min至乙醇充分挥发。
12、 取下离心管,加入100 μL洗脱液,振荡混匀使磁珠完全浸没在洗脱液中,再置于65 ℃孵育10 min,期间混匀2次。
13、 将离心管短离心,置于磁力架上,静置30 s,待磁珠完全吸附,用移液器将液体转移至一新离心管中(切勿吸到磁珠),所得溶液即为提取的核酸样品。
14、 该样品可以直接用于下游实验,若要长时间保存,请置于-20 ℃冰箱。本回答被网友采纳
第2个回答  2018-12-04
用试剂盒最方便了!相比用化学溶剂等检测的耗时耗力甚至毒害,BIOG安全无毒,对操作人员没有伤害,按说明书操作就好,快速简便,在20分钟内就可以完成,提取DNA纯度高,无抑制剂,A260/A280为1.7-1.9,产率高,同样的样本量提取的DNA更多
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