单克隆抗体的制备过程分为几个关键步骤:
首先，进行免疫动物。选择6-8周龄雌性Balb/c小鼠，通过免疫注射，使用目的抗原刺激其产生致敏B淋巴细胞。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，激活并增殖B淋巴细胞，形成致敏细胞。
接着，进行细胞融合。小鼠经眼球摘除放血法处理后，无菌取出脾脏，与同系骨髓瘤细胞混合，并加入聚乙二醇促进融合。在融合过程中，淋巴细胞与骨髓瘤细胞结合形成杂交瘤细胞，这些细胞具有独特的融合特性。
选择性培养是筛选过程，使用HAT培养基筛选出融合的杂交瘤细胞。只有融合的杂交瘤细胞能在HAT中存活，因为它们获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，同时具有无限增殖的能力。
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞需进一步筛选和克隆化，通过有限稀释法选择能产生特定单克隆抗体的细胞，并进行扩增和鉴定。免疫球蛋白类型、亚类等特性确认后，进行冻存保存。
最后，大规模生产单克隆抗体采用两种方法：体内诱生法和体外培养法。体内诱生法中，将杂交瘤细胞植入小鼠腹腔，通过腹水收集抗体。体外培养法则将杂交瘤细胞在培养瓶中培养，收集上清液分离出抗体，尽管产量有限，但新型培养技术的进步已显著提升产量。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。