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http://www.cqvip.com/qk/98340X/200802/27822236.html 一、无菌培养物的建立 :建立无菌培养物的三项技术: (1)外植体的选择 (2)灭菌 (3)诱导培养对于易褐变的外植体还要有防止褐变的措施。1、 外植体的选择(1)遗传表型选择:(2)生理状态的选择:(3)取外植体的部位:(4)取外植体的季节和时间:(5)外植体大小与诱导成功率:2、外植体的灭菌消毒原则既要彻底消灭外植体表面的微生物,又要保持外植体正常活力。消毒剂良好的消毒作用,又要易被无菌水冲掉或自行分解掉。消毒程序消毒剂种类、浓度和消毒时间。 目前常用消毒方法:首先70~75%酒精,30秒,表面杀菌,后用其他消毒剂消毒;如: 0.1%升汞,5~10分钟 2~5%次氯酸钠,5~30分钟茎尖、茎段、叶片消毒程序:——70%乙醇30秒 —— 无菌水2~3次 —— 2~5%次氯酸钠10~15分 —— 无菌水3~5次种子的消毒程序:——10%次氯酸钠20~30分——无菌水3~5次根的消毒程序:——自来水冲洗——纯乙醇漂洗——0.1%升汞5~10分——无菌水3~5次3、诱导培养(1)外植体的切割:叶片0.5~0.8 cm2;茎段和顶芽以1cm长为宜。(2)接种:形态学下端插入培养基(如茎切段),叶平铺。不可将切块深埋于培养基中,以防无氧呼吸。(3)最佳培养基的筛选:主要因素: 基本培养基,植物生长物质的种类、浓度和配比。二、培养物的增殖(茎芽的增殖)是 离体繁殖 也称 微型繁殖 的关键步骤。1、通过愈伤组织诱导不定芽的形成不定芽(adventitious buds )是指从非正常(叶腋和茎尖)出芽的位置上诱导而形成的芽,如从根、叶和愈伤组织中诱导的芽 。优点:繁殖速度快。不足:遗传不稳定性;再生能力会下降。2、增强腋芽生枝能力含CTK、GA和生长素等的培养基,可增强枝条腋芽生枝能力。特点:此途径开始速度慢,但经一个时期后,枝条数目以对数增加;此途径为茎尖培养,所以不发生基因型的变化。注意:(1)繁殖代数不是越多越好;(2)每次继代培养,应求增殖系数最高,即产生数量最多的增殖体。三、根的诱导培养一般在增殖的芽长到1-2厘米时,即可转入生根培养基培养。生根培养基配方的筛选原则:发根快、多而粗壮,茎基部不形成愈伤组织。生根培养基应去除CTK,降低生长素浓度,甚至在无激素的培养基上进行发根。四、试管苗的移栽1、壮苗;2、炼苗; 3、移栽的适期:小苗刚发根或幼根小于1厘米时为移栽适期。