DNA提取主要是CTAB方法,其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有;硅质材料、阴离子交换树脂等。
提取DNA总的原则:
1.保证核酸一级结构的完整性;
2.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;
3.其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度;
4.其他核酸分子,如RNA,也应尽量去除。
例如 : 用酶法提取
DNA提取分为三个基本步骤,每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
工具/原料: 研磨棒、研磨仪或者组织破碎仪 , 氯仿:异戊醇(24:1)或者蛋白酶 , RNA酶 , 酒精 , 冰箱
方法/步骤 :
使用研磨仪、研磨棒或者使用超声破碎细胞的方法破碎细胞,加入去污剂,如sds等,除去膜脂。
去除细胞内的蛋白质,包括与DNA结合的组蛋白,通过加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提等方法去除。
加入RNA酶去除RNA,如实验不严密,可省略此步。
沉淀DNA,需在冷乙醇或异丙醇中沉淀,放在冰箱-20℃沉淀30分钟以上,原理是DNA在醇中不可溶而黏在一起发生沉淀。
总结: DNA提取方法有下面⑦种
一.酚抽提法:先用蛋酶K、SDS破碎细胞,消化蛋白,然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb
二.甲酰胺解聚法:破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒缠绕法:用盐酸胍裂解细胞,将裂解物铺于乙醇上,然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅,DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
四.异丙醇沉淀法:基本同1法,仅用二倍容积异丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态)
五.表面活性剂快速制备法:用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞,然后用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。
六.加热法快速制备:加热96℃-100℃,五分钟,然后离心后取上清,可用于PCR反应。
七.碱变性快速制备:先用NaOH作用20分钟,再加HCI中和,离心后取上清,含少量DNA。
采样步骤说明】
1、操作前确定一次性宫颈采样拭子是独立包装完整无破损,检查细胞保存管是否有破损或漏液现象。
2、取出一次性宫颈采样拭子,调整至取样刷的圆盘处在卡口A和B之间,取样刷刷头在套管中不露出;
3、操作者握住套管的防滑纹处,将拭子(此时取样刷刷杆的圆盘处在卡口A和B之间)自阴道缓慢插入,至宫颈外口处为止(此时应该略有阻力,但不感到疼痛);
4、单手固定住套管,将取样刷按图示方向轻推,使取样刷杆的圆盘穿过套管内部的卡口A,表明取样刷刷头已露出套管,然后再继续往里轻推约1厘米,使刷头完全露出套管并接触到宫颈外口;抵住刷柄,将取样刷以同一方向缓慢转动4-5圈,以采集到足够的宫颈细胞(注意用力要适中,太轻不能取到足够的细胞,太重可能损伤宫颈引起出血);
5、采集完细胞后,单手固定住套管,另一只手握住刷柄按图示方向稍用力往外拉,使取样刷刷杆的圆盘退回到套管内部的卡口A与卡口B之间。
将套管和取样刷一起缓慢退出阴道
(将刷头推出套管)
6、单手固定套管,另一手按图示方向推动刷柄,使取样刷杆的圆盘穿过卡口A,暴露刷头于套管外直至露出刷头端的凹槽处(注意刷头不要接触到其他物体);
(产品性能为收集病毒标本)
7、打开与取样器配套的细胞保存管(装有2ml易挥发细胞保存液),将刷头浸入液面,固定瓶身,充分搅动10次以上,以使采集的标本完全释放在细胞保存液中(如不慎沾液,用清水冲净即可);
(折断刷头)
8、单手固定细胞保存管,按图所示,从刷头端的凹槽处折断自取样刷,保留刷头在细胞保存液内,拧紧细胞保存管的管盖,丢弃刷柄及套管部分。
口腔拭子 DNA提取的方法
1、加入600ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,70°C放置10 min。此时溶液应变清 亮,简短离心以去除管盖内壁的液滴,然后挤压去除拭子,将尽可能多的裂解液 转移至新的离心管中。 。
二、口腔拭子基因组 DNA 提取( 使用前,请先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇,加入体积请参照 瓶上的标签。 1. 处理材料: 将在面颊内擦拭过的棉签转置于 2ml 离心管中,用剪刀将棉签部分从其杆 上剪下,加入 600ul 缓冲液 GA。
注意:如果需要去除RNA,可加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液,振荡15 sec ,室温放置5 min。 2. 加入40ul Proteinase K溶液,涡旋10 sec混匀,56°C放置20 min,其间每7 min涡旋混匀数次。