荧光分析原理主要基于分子在吸收特定波长的光后发生的能级跃迁。当分子吸收光子，通常从基态的最低振动能级跃迁至第一或第二电子激发态的各个振动能级（图1a、图b）。接着，大部分分子会快速回到第一电子激发态的最低振动能级，这一过程可能因与其他分子碰撞而消耗能量，导致不发射光（图1c）。只有极少数分子会直接跃迁至电子基态，释放多余能量形成荧光，这一过程发生在图1d所示的状态。部分分子可能通过无辐射跃迁到达亚稳的三重线态，经过热激活返回第一激发态，最终从最低振动能级释放荧光，这种荧光被称为迟滞荧光，见图1e、g、h。
荧光分析的两个关键条件是：物质分子必须具有能吸收激发光的结构，如共轭双键；以及一定的荧光效率，即荧光物质发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数的比值。通过荧光光谱和激发光谱的测定，我们可以了解分子的荧光特性。荧光光谱（发射光谱）通过测定荧光物质在不同波长下的发射强度，而激发光谱则分析激发不同波长的荧光强度。紫外-可见光区的荧光产生与跃迁至电子基态无关，光谱形状与激发光波长无关。
物质的吸收光谱由第一激发态的振动能级分布决定，吸收峰的波长与能级差距有关。相反，荧光光谱（发射光谱）由电子基态的振动能级分布决定，荧光峰的波长与基态能级的差距成反比。荧光强度的测量与溶液的吸光强度、荧光效率、物质浓度、溶剂特性、温度和pH值等因素密切相关。在稀溶液中，荧光强度与物质浓度呈正比，但荧光猝灭现象会因分子间的相互作用而降低荧光强度。
荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。