第4个回答 2019-02-18
(1)将CB溶于二甲基亚砜中(DMSO),即1mLCB加1mLDMSO作为母液,4℃可存放三年,使用时以1:100加入培养基中,使其最终浓度为10μg/mL。
(2)培养用的塑料圆板的处理:用无毒的Polystyrene塑料圆板,厚度需1~1.5mm大小可随离心管直径大小而定,只需比离心管口径略小1~1.5mm,圆板两侧要有两个凹陷以便用镊子挟取,为了便于圆板的支撑和平衡离心,在离心管中加入一个圆筒状的塑料垫圈,垫圈高2~2.5cm,周边厚度为2cm,其外径应与圆板的大小相当,使其与离心管的口径略小,在离心管中可方便插入和取出,离心前应先把垫圈投入离心管中,把圆板稳固地扣盖在垫圈上(令其细胞朝下),然后加入CB液略超过圆板,以浸没细胞。
离心管可用高压灭菌,塑料圆板垫圈可用60CO辐照,也可用95%酒精浸过夜,取出用无菌蒸馏水漂洗2~3次,用紫外线对其两面照射20~30分钟或更长后,即可使用。[1]
脱核程序
(1)用能贴壁生长的单层细胞,取数个塑料圆板置入平皿中,接种已制备好的细胞悬液,置37℃%CO2培养。
(2)待细胞形成单层时,在无菌条件下将细胞圆板扣盖在离心管的垫圈上,令细胞面向下,加入CB(10mg/L)培养基,使其淹没圆板为宜,为了防止圆板离心时翻转,在圆板上再放入同直径的圆柱形垂锤。
(3)有99%细胞的核被脱掉,为防止细胞丢失离心速度不要太高,离心时间不宜太长)。
(4)离心脱核后,沉于管底的为胞核,圆板上的细胞为脱核的胞质体,用PBS漂洗2次,每次1~2分钟可置入培养液基(不含CB)继续培养,使细胞恢复原先的正常形态。取出固定染色,也可进行细胞融合及染色质导入试验,或将胞膜、胞浆分离进行成分分析,或开展膜结构研究。沉于管底的核,因核周围仍包有薄层胞质和CB,可采用培养液漂洗1~2次,然后用于融合,或将核中染色质导入另一新细胞,或吸出涂片,固定,染色,制成标本。[1]