如何提取大肠杆菌质粒DNA？

Question

如题所述

Answer 1

碱性裂解法提取质粒原理如下：

在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽变性但仍处于拓扑缠绕状态。

将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。

通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

抽提质粒DNA常用碱裂解法，它是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。

当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时，染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤、可得到较纯的质粒DNA。

碱裂解法通常有大量提取法和小量提取法，其提取原理是一样的，只需体积按一定比例扩大。纯化质粒DNA时通常还利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。开始进行克隆时，对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提。

RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。要使用特殊纯化的质粒时，可采用氯化铯方法抽提，但该方法比较复杂，对技术要求高，花费时间长，也比较昂贵。