科马洛夫于1960年入选苏联第一组宇航员，并曾作为帕维尔·波波维奇的替补队员参与了东方4号任务。他本人第一次进入太空是在上升1号任务，而在他的第二次飞行任务联盟1号中，他因飞船降落伞故障而死于飞船坠毁。
科马洛夫的妻子是瓦伦缇娜·雅科夫勒夫纳·凯瑟尤娃，并有两个孩子：耶夫基尼和艾琳娜。
初中语文第5册《悲壮的两小时》介绍了苏联宇航员科马洛夫失事丧生前的感人事迹。称1967年苏联“联盟一号”宇宙飞船在返回大气层后，发现无法打开降落伞以减慢飞船速度，将在两小时后坠毁。此刻全国的电视观众都在收看宇宙飞船的返航情况，科马洛夫在其生命的最后两个小时，当着全国观众的面向领导汇报工作，接受国家领导人授予的“苏联英雄”称号，并向老母、妻子、女儿一一交代后事，遗言相当感人。
可惜这个感人的故事完全是凭空捏造的，既不符合历史事实，也毫无科学依据。事实是：“联盟一号”的飞行是冷战期间苏联为了与美国竞争登月而进行的绝密行动，并没有电视直播“联盟一号”宇宙飞船返航的过程，而是在失事几个小时之后，才由塔斯社将这不幸的事故公之于众。而且，从科马洛夫发现飞船返回舱打不开降落伞，到坠毁丧生，只有十余分钟的时间，而不是“悲壮的两小时”。当时空军现场指挥官报告说需要急救措施，然后掐断了通讯联系，科马洛夫没有留下任何遗言。
美国国家安全局的分析专家——在书中的姓名为佩里·菲尔沃克，讲述了在1967年的太空飞行任务期间，科马洛夫与地面控制中心官员的通话，告诉他们，他可能活不成了。菲尔沃克还在美国设在土耳其的监听所监听到科马洛夫和苏联前总理阿列克谢·柯西金(Alexei Kosygin)的对话。据菲尔沃克说，他能听到柯西金痛哭的声音，并告诉科马洛夫他是英雄。 这些令人震惊的绝密内容都出自一本名叫《星人：尤里·加加林传奇背后的真相(Starman, The Truth Behind the Legend of Yuri Gagarin)》新书里，该书由佳米·多兰和皮尔斯·彼祖恩合著，将于下个月出版。这本新书讲述了科马洛夫和他的同事加加林(苏联英雄，首位进入外太空的人)之间的深厚友谊。据《星人》介绍，他们二人都被指派参与这项地球轨道飞行任务，而且他们都知道那艘飞船不安全。
当时科马洛夫已婚，有两个子女，他知道他可能会死，但他拒绝退出该任务。加加林是他的替补，他不想让自己的朋友去送死。俄罗斯打算用“联盟1”号先把科马洛夫发射升空，第二天再借助一艘飞船把另外两名宇航员送入太空。两艘飞船在空中汇合，对接，然后科马洛夫爬到另一艘飞船里，乘坐第二艘飞船重返地球。然而正如该书所说，这项任务注定会以失败而告终。 有关人员对“联盟1”号进行检查，发现203处结构性问题，这些问题会让飞船在太空中的飞行变得很危险。然而，没人敢把这些问题上报给当时的苏联领导人勃列日涅夫，害怕会被降职、开除。因此这项任务仍按计划如期进行。距离发射还有不到一个月时，科马洛夫与被降职的克格勃特工温亚明·鲁萨耶夫见面，告诉他：“这次飞行任务我不会再活着回来了。” 当鲁萨耶夫问他为何不退出任务时，科马洛夫回答说：“如果我不执行这次飞行任务，他们就会让替补飞行员去。而加加林是我的替补。他会替我而死。我们说好要好好照顾他的。”说完科马洛夫掩面痛哭。1967年4月23日发射当天，“联盟1”号发射升空时并没出现问题，但随后故障就接踵而至。
进入太空后，飞船的天线未能正常打开、电力不足、导航也是困难重重。原定于第二天的发射任务被取消，科马洛夫安全重返地球的希望随之化为泡影。当飞船开始下降的时候，降落伞并未打开。只有小降落伞弹了出来，更大的被卡住。备用降落伞与小降落伞缠在了一起。书中描写了美国情报机构“听到(科马洛夫)在赴死时发出的绝望的咆哮声”。 科马洛夫乘坐的飞船坠落在俄罗斯奥伦堡附近的平原上。飞船被撞扁，用于缓冲的火箭也在猛烈碰撞中发生爆炸。据鲁萨耶夫说，人们在废墟里只找到科马洛夫的一个足骨，其他什么也没有。科马洛夫享受到国葬的待遇，他的遗骸被放置在一个敞口棺木里。加加林对朋友的死一直耿耿于怀，1968年他也在一次飞机事故中丧生，这发生在美国成功登上月球的前一年。
经追查，《悲壮的2小时》的作者是冯峰鸣，单位是山东青州文化馆。原文还有一段过于离谱的文字：“一位青年，发疯一般冲进指挥台，抢过了话筒：“科马洛夫同志。请让我与您说一分钟的话!科马洛夫，我是你的情敌，是你情人的丈夫。一个小时前，我还恨你。想等你回来与你决斗．我发督要杀死你。现在我明白了，她为什么会爱你。你是最崇高最伟大的男子汉！就让她爱你吧！我也爱你！全苏联人都爱你!全世界的人都爱你！”
1971年7月，美国的“阿波罗”15号飞船登月时，宇航员大卫·斯科特将比利时艺术家霍伊东克制作的一个很小的铝制雕塑《倒下的宇航员》安放在月球上，旁边是一块刻着美苏两国十四位在航天飞行或训练过程中牺牲的宇航员名字的纪念牌，其中，就有科马洛夫的名字。
