从新冠核酸检测到PCR引物探针设计3

Question

如题所述

Answer 1

在前两篇文章中，我们已经深入探讨了CDC试剂盒的组成部分、结果解读、引物探针的特异性以及Tm值的重要性。本章我们将聚焦于引物探针设计中的关键环节——二聚体和发夹结构，它们如何影响PCR反应的效率和灵敏度。

1. ORFlab基因引物探针的二聚体效应

设计时，通常要求控制引物自身的二聚体（自身或配对）形成△G值大于-4.5kc/mol。然而，ORFlab基因引物的3'端△G值过高，可能导致错配位点形成不稳定双链，影响PCR反应。3'端△G值过高，如ORFlab上游引物的-13.4kc/mol，极可能形成稳定的二聚体，显著降低PCR效率。而自身二聚体结构，如下游引物的-6.3kc/mol，虽低于阈值，但仍有潜在影响。

2. N基因引物探针的二聚体挑战

N基因的引物自身二聚体情况同样不容乐观。下游引物的-5.1kc/mol和上游引物的-6.3kc/mol都小于-4.5kc/mol，理论上可能影响扩增效率。配对二聚体中，下游与探针的-10.2kc/mol结构不稳定，严重影响反应，而上下游的配对结构则相对平衡。

3. 发夹结构的影响

发夹结构的自由能值决定了其稳定性。ORFlab的发夹结构△G=-2.2kc/mol，可能导致探针利用率下降，荧光信号偏低。而N基因的发夹结构接近于平衡，不会明显干扰反应。

4. 引物间的交叉二聚体

当ORFlab与N基因共存时，它们之间的二聚体结构，如ORFlab下游与N基因下游的-8.3kc/mol，会显著干扰PCR反应，降低检测的准确性。

尽管中国CDC公布的新冠核酸检测引物探针在假病毒和质粒样本上表现良好，但在临床样本中的表现却与预期有所偏差。这提示我们，引物探针设计的精细度在实际应用中的重要性不容忽视。

尽管我们对CDC专家的专业能力充满信心，但引物探针设计并非一蹴而就。每一步细节都可能影响最终的检测结果，这也是我们接下来要深入研究的美国CDC和WHO公布的引物序列的原因。

以上仅为个人观点，希望能为理解PCR引物探针设计的复杂性提供有价值的见解。期待我们在科学的探索中，逐步揭示更多真相。