年产10万吨糖化酶的工业提取工艺

Question

相关流程介绍，设备,参数（如：相关步骤的PH值，温度，压强，设备的选择参数，型号等）及选择,注意事项，分固化酶，液化酶来解说

Answer 1

http://www.niangzao.net/news/482/48266.html
食品添加剂糖化酶制剂的发酵制取技术
作者:| 来源:中国食品科技网| 编辑:王治华|2006-6-23| 点击:242

本标准适用于由发酵法生产,经提纯制取,供食品生产作添加剂用的糖化酶制剂。

1、技术要求

1.1外观:固体时,粉状,无结块。液体时,黄褐色,允许有少量凝集物。

1.2项目和指标表1

项目 指标

固体 30000,40000,20000,30000

液体 50000,60000,40000,50000

酶活力,u/g(ml)80000,100000,60000,80000

150000,200000,

水分,％不小于8.0

细度(通过40目铜网筛)％不小于80

酶活力保存率(室温,半年),％不小于80

重金属(以pb计),％不超过0.004

铅,％不超过0.001

砷(以as计),％不超过0.0003

黄曲霉毒素b1,％不超过0.0000005

大肠菌群,个/100g(ml)不超过30

沙门氏菌不得检出

2、试验方法

2.1外观:用目视判定。

2.2酶活力测定

2.2.1试剂

2.2.1.10.1n乙酸-乙酸钠缓冲溶液(ph4.6):称取6.7g乙酸钠(ch3coona·3h2o),吸取冰乙酸2.6ml,用蒸馏水溶解定容至1000ml,上述缓冲溶液应以酸度计校正ph值。

2.2.1.20.05n硫代硫酸钠溶液:按gb601《化学试剂标准溶液制备方法》中2.7执行。

2.2.1.30.1n碘液:按gb601《化学试剂标准溶液制备方法》中2.10执行。

2.2.1.40.1n氢氧化钠溶液:按gb601《化学试剂标准溶液制备方法》中2.2执行。

2.2.1.52n硫酸溶液:量取分析纯浓硫酸(比重1.84)5.6ml缓缓加入适量蒸馏水中,冷却后用蒸馏水定容至100ml,摇匀。

2.2.1.620％氢氧化钠溶液:称取20g分析纯氢氧化钠,用蒸馏水溶解定容至100ml。

2.2.1.72％可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉2.00g,然后用少量蒸馏水调匀,徐徐倾入已沸的蒸馏水中,煮沸至透明,冷却,用蒸馏水定容至100ml,此溶液需当天配制。注:可溶性淀粉应符合hg3-3095质量标准要求。

2.2.2测定程序

2.2.2.1待测酶液的制备:称取酶粉2.0000g(或1.00ml酶液),倒入50ml烧杯中,用少量的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(ph4.6)溶解,并用玻璃棒捣碎,将上层清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣再加入少量上述缓冲溶液,如此反复捣研3～4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲溶液定容至刻度,摇匀,通过4层纱布过滤。再用滤纸滤清,滤液供测定用。浓缩酶液可直接吸取一定量于容量瓶中,用缓冲溶液稀释定容至刻度。注:制备酶液时,酶液浓度最好控制在消耗0.05n硫代硫酸钠(空白-样品)的差数为3～6ml左右(以每毫升酶活力约50～90单位为宜)。

2.2.2.2测定:于甲、乙两支50ml比色管中,分别加入2％可溶性淀粉溶液25ml,0.1m乙酸-乙酸钠缓冲溶液(ph4.6)5ml,摇匀。于40±0.2℃的恒温水浴中预热5～10min。在甲管中加入酶制备液2.0ml(酶的总活力约110～170单位)立即记时,摇匀。在此温度下准确反应1h后,立即在甲、乙两管各加20％氢氧化钠溶液0.2ml,摇匀,将两管取出迅速用水冷却,并于乙管中补加酶制备液2.0ml(作为对照)取两管中上述反应液各5ml放入碘量瓶中,准确加入0.1n碘液10ml,再加0.1n氢氧化钠溶液15ml(边加边摇晃),放置暗处15min,加入2n硫酸2ml,用0.05n硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。

2.2.2.3计算1g酶粉或1ml酶液在40℃、ph4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

132.2

x＝(a-b)×n×90.05×━━×━━×n………………(1)

25

式中:x--酶活力单位,μ/g(ml);a--空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;b--样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;n--硫代硫酸钠溶液的当量浓度;n--稀释倍数;90.05--1ml1n硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数;1/2--折算成1ml酶液的量;32.2--反应液总体积,毫升数;5--吸取反应液的毫升数。为计算方便,可按稀释倍数参考表计算,系数乘以滴定空白和样品所消耗0.05n硫代硫酸钠溶液的差值(a-b)为酶活力单位。稀释倍数参考表2。

表2 稀释倍数参考表

稀释倍数 系数 稀释倍数 系数

原数 14.5 35 507.5

2 29 40 580

5 72.5 45 625.5

1014550725

15 217.5 100 1450

20 290 200 2900

25 362.5 250 3625

30 435

2.3 水分

2.3.1 测定程序于已知恒重的40mm×25mm称量皿中,称取酶粉约2.0000g,在105～110℃恒温干燥箱内烘2h,移至干燥器中冷却,称重,再在干燥箱内烘干,直至恒重。

2.3.2 计算

w1－w2

x1＝━━━━×100………………………………………(2)

w1－w

式中:x1--样品中水分的含量,％;w--称量皿质量,g;w1--烘干前皿加样品质量,g;w2--烘干后皿加样品质量,g。

2.4 细度

2.4.1 测定程序称取100g酶粉用40目标准分样筛(铜网)筛分,称其未通过的酶粉质量。

2.4.2 计算

m－m

x2＝━━━━×100………………………………………(3)

m

式中:x2--酶粉样品细度,％;m--原酶粉质量,g;m--筛后留存酶粉质量,g。

2.5 酶活力保存率

e1

x3＝━━━━×100………………………………………(4)

e

式中:x3--酶活力保存率,％;e--原酶粉(液)活力;e1--检测酶活力。

2.6 重金属

2.6.1 试剂

2.6.1.1 硝酸:分析纯。

2.6.1.2 硫酸:分析纯。

2.6.1.3 盐酸:分析纯。

2.6.1.3.1 6n盐酸:量取500ml盐酸,用蒸馏水稀释至1000ml。

2.6.1.3.2 1n盐酸:量取83ml盐酸,用蒸馏水稀释至1000ml。

2.6.1.4 氨水:分析纯。

2.6.1.4.1 5n氨水:量取333ml氨水,用蒸馏水稀释至1000ml。

2.6.1.4.2 1n氨水:量取66ml氨水,用蒸馏水稀释至1000ml。

2.6.1.5 ph3.5的乙酸盐缓冲液:称取25.0g乙酸铵溶于25ml蒸馏水中,加6n盐酸45ml,用稀盐酸或稀氨水调节ph至3.5,用蒸馏水稀释至100ml。

2.6.1.61％酚酞指示液:按gb603配制。

2.6.1.7饱和硫化氢水:按gb603配制(此溶液于使用前制备)。

2.6.1.8铅标准溶液(每毫升含0.01mg铅):按gb602配制,临用前用蒸馏水稀释10倍。

2.6.2测定程序

2.6.2.1样品处理称取5.0g样品置于250ml凯氏烧瓶或三角烧瓶中,加10～15ml硝酸浸润样品放置片刻(或过夜)后,缓缓加热,待作用缓和后稍冷,沿瓶壁加入5ml硫酸再缓缓加热,至瓶中溶液开始变成棕色,不断滴加硝酸(如有必要可滴加些高氯酸)至有机质分解完全,继续加热,至生成大量的二氧化硫白色烟雾。最后溶液应呈无色或微带黄色。冷却后将溶液移入50ml容量瓶中,用水洗涤三角烧瓶,将洗液并入容量瓶中,加蒸馏水至刻度,混匀,每10ml该溶液相当于1g样品。取同样重的硝酸、硫酸按上述方法作试剂空白试验。

2.6.2.2样品测定

2.6.2.2.1溶液a:吸取含铅标准液1ml于50ml纳氏比色管中,加水至25ml混匀,加1滴1％酚酞指示液；用稀盐酸或稀氨水调节ph至中性(酚酞红色褪去)。加入ph3.5的乙酸盐缓冲液5ml,用蒸馏水稀释至40ml,混匀备用。

2.6.2.2.2溶液b:取一支与溶液a所配套的纳氏比色管,加入20ml样品液,加蒸馏水至25ml混匀,加1滴1％酚酞指示液,用稀盐酸或稀氨水调节ph至中性(酚酞红色褪去),加入ph3.5的乙酸盐缓冲液5ml,用蒸馏水稀释至40ml,混匀备用。

2.6.2.2.3溶液c:取一支与溶液a、b所配套的纳氏比色管,加入与溶液b相同量的样品液,再加入与溶液a相同量的铅标准液,加蒸馏水至25ml,混匀,加1滴1％酚酞指示液,用稀盐酸或稀氨水调节ph至中性(酚酞红色刚褪去),加入ph3.5的乙酸盐缓冲液5ml,用蒸馏水稀释至40ml,混匀备用。

2.6.2.2.4向各管中加入10ml新鲜制备的硫化氢饱和液,混匀,放置10min后在白色背景下观察,溶液b的色度不得深于溶液a的色度,溶液c的色度应与溶液a的色度相当或深于溶液a的色度。

2.7铅按gb5009.12《食品中铅的测定方法》中的双硫腙单色法执行。样品处理采用硝酸－硫酸法。

2.8砷按gb5009.11《食品中总砷的测定方法》中的银盐法执行。样品处理采用硝酸－硫酸法。

2.9黄曲霉毒素b1按gb5009.22《食品中黄曲霉毒素b1的测定方法》执行。

2.10大肠菌群按gb4789.3《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》执行。

2.11沙门氏菌按gb4789.3《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》执行。

3检验规则

3.1产品需经生产厂技术部门检验,并签发合格证方可出厂。生产厂以每一生产班次或每一罐进库的量为同一批次的产品。

3.2订货单位若需抽样检验,应从该酶制剂中提取两份,按本标准规定的试验方法进行检验。若有一个样品或一项指标不符合标准的要求,应与生产厂协商。再取一倍量的同批样品共同进行复验,如仍不合格时,则全批产品作为不合格品,退交生产厂处理。若产品经复验合格,订货方应承担试验费用。如不合格,应由生产厂家承担试验费用。

4标志、包装、运输、贮存

4.1酶制剂的外包装箱,除注明品名、生产厂名、规格、注册商标外,还应注明食品添加剂。箱里并应附有产品检验合格证,合格证上印有品名、批号、数量、规格、生产日期、检验员等。

4.2内包装为食品用塑料袋,包装分为2kg、3kg,应印有注册商标、产品名称、规格、重量、生产厂名。

4.3本品含有生物活性物质,对光线、温度、湿度易引起失活。在运输途中应避免日光曝晒和雨淋。贮存仓库应保持清洁、阴凉、干燥、通风。

附加说明:

本标准由中华人民共和国轻工业部、卫生部提出。

本标准由轻工业部食品发酵工业科学研究所、卫生部食品卫生监督检验所归口。

本标准由无锡酶制剂厂、轻工业部食品发酵工业科学研究所、天津市卫生防病中心、无锡市卫生防疫站负责起草。

http://engine.cqvip.com/content/tq/91583x/1995/000/003/gc15_tq12_1860539.pdf
表面上看，糖化酶生产的发酵技术，后提取工艺及设备等较其它发酵制品简单，再加上我国糖化酶用量大，生产糖化酶设备投资 ... 食品袅或工业袅) 包装(食品袅) (工业级) 匣1 冀化蘸成品制备流翟五、结论1．采用正交试验法进行摇瓶发酵试验，确定了最佳摇

http://www.wanfangdata.com.cn/qikan/periodical.Articles/spyfx/spyf99/spyf9902/990211.htm
精制液体糖化酶的开发研制*

曾 辉 何新民 张新武 刘仲敏

摘 要 根据高转化率糖化酶发酵成熟醪的特性，对生产液体酶的絮凝剂和絮凝方法进行了筛选研究，形成了一套独特且适用于工业化生产的絮凝工艺。采用先进的板框预涂工艺和超滤膜浓缩分离技术，高效回收了产品，使单罐回收率达到80%，综合平均回收率达75%以上，比传统盐析工艺平均提高7%。
关键词 糖化酶 絮凝 回收率

通常，在发酵行业中人们往往注重于提高菌种发酵活力而忽视提高产品的回收率，其结果是丰产不丰收。本研究采用独特的絮凝工艺，以板框预涂、超滤膜浓缩法生产精制液体糖化酶，提高了产品质量档次(由工业级跨入食品级)，减少了滤液对环境的污染，比传统盐析工艺回收率平均提高7％，综合平均回收率达到75％以上。产品各项技术指标完全符合QB1805.2-93工业用糖化酶制剂优等品标准，3个月酶活力保存率大于95%。

1 材料与设备

(1)絮疑剂：APAM、苯甲酸钠、硅藻土、硫酸锌、黄血盐等。
(2)防腐剂：醋酸钙、青霉素、山梨酸钾、苯甲酸钠等。
(3)絮凝罐：V=20 m3，转速：50～70 r/min。
(4)聚丙烯板框压滤机：60 m2。
(5)滤布洗涤机。
(6)预涂罐：V=3 m3，转速：80 r/min。
(7)进口UF809型卷式膜超滤机。
(8)贮罐：V=20 m3。
(9)成品处理罐：V=3 m3，转速：50 r/min。

2 精制浓缩液体糖化酶提取工艺研究

2.1 工艺路线的确定
确定本工艺的核心是选择浓缩方法和确定絮凝工艺。目前国内同类产品采用的浓缩方法有2种，一种为依靠热源来蒸发产品中的水分；另一种为利用渗透膜超滤除去产品中的水分。比较上述2种方法，前者设备投资大、耗能多；而后者投资少、耗能低，且操作简单、清洗方便、维修及更换成本低，产品收率高。因此，我们选择了先进的渗透膜超滤浓缩方法。絮凝工艺是提取工艺中最关键的一步，直接决定板框过滤等工序的工作与产品的质量。近年来，对絮凝工艺的研究都集中在絮凝剂的选取上，我们根据实际情况选取了几乎不含无机金属离子的絮凝剂和高效的过滤方法。
2.2 工艺流程
酶发酵液 → 絮凝 → 板框压滤 → 滤液
↓ ↓
滤饼 超滤浓缩
↓ ↓
干燥后作填充剂或饲料 防腐和标准化处理
↓
成品
2.3 酶发酵液的质量
酶发酵液的质量直接决定产品的质量和收率。我们对发酵液质量制订的指标见表1。

表1 酶发酵液质量指标

项目 镜检情况 酶活力(u/ml) pH DE值
指标 镜检正常
无杂菌 ＞2.5×104 4.2～4.6 ＜10

对于个别批次发酵液达不到上述指标要求的，均改为生产固体粉剂。
2.4 絮凝工艺的研究
精制浓缩液体糖化酶的生产过程中，絮凝工艺是最关键的一步。如果絮凝效果不好，将导致处理时间长，增加染菌的可能性。
采用絮凝工艺对发酵液进行预处理可除去发酵液中的菌体和其它不溶性粒子，从而大大改善了发酵液的过滤性，提高了澄清度。对于絮凝的作用机理有如下解释：
(1)絮凝剂中和了悬浮粒子表面上的电荷(菌体细胞表面上亦存在着羧基和氨基，故带有电荷)，最终导致了这些粒子的絮凝。
(2)絮凝剂的包埋或吸附作用，把菌体及其它不溶性粒子机械地吸附并包埋在其中。
2.4.1 絮凝小试对比试验
每次取100 ml样品按下述絮凝方法进行絮凝，然后用漏斗内衬滤纸进行常压过滤。
方法1：取原样直接用滤纸过滤。
方法2：加水1/3、麸皮1％、硅藻土2％。
方法3：加水1/3、APAM适量。
方法4：加水30%～40%、加膨润土、硅藻土、苯甲酸钠、APAM适量。
方法5：加水1/3、木屑1%、依次加入适量硫酸锌、黄血盐、APAM。其结果见表2。
从表2可知，方法4、5为最理想的絮凝方法,其滤液清澈透亮，滤速快，滤饼水分少，可应用于大规模生产。方法4更符合食品卫生标准。方法1、2、3存在不同程度的问题，应淘汰。
表2 絮凝方法小试结果

方法 滤速(s/10滴) 滤液颜色 滤液亮度 滤饼状况 结果分析
1 40 深红棕色 透 亮 滤饼未挤前不分离，成糊状。 难过滤型，此方法不采纳。
2 14 浅黄色 亮度不够 滤饼未挤前成疏松状,分离好。用纱布包滤饼进行挤压,饼成块状,易挤干,水分少。 易过滤型, 此法加快滤速后可采纳。
3 8 浅黄色清液 透 亮 未挤前滤纸上无糊状,外观分离程度不如方法2。用纱布包滤饼进行挤压,用力大,水分多,饼成软团状。 过滤效果好,但饼难挤干,不疏松，饼水分大。
4 6 浅黄色清液 透 亮 滤饼未挤前成疏松状,分离好。用纱布包滤饼进行挤压,饼成块状，易挤干，水分少。 较好的一种过滤方法,应采纳。
5 7 浅黄色清液 清澈透亮 同 4

较好的一种过滤方法,应采纳。

2.4.2 工业化生产
在小试基础上，我们又采用4种方法对4批次发酵液进行了工业化絮凝过滤处理 (按6m3发酵液计算加量)。
方法1：发酵液不经任何处理，直接过滤。
方法2: 加入1％的木屑和2％的硅藻土后进行过滤。
方法3: 加入1/3的纯净水，1％的木屑，依次加入适量的硫酸锌 、黄血盐、APAM后进行过滤。
方法4: 加入1/3的纯净水，1％的硅藻土，适量膨润土、苯甲酸钠、APAM。加入絮凝剂后搅拌30 min(转速50～80 r/min)后进行过滤。其结果见表3。
从表3可以看出，方法1、方法2处理时间长，滤液也没有后两种方法清亮，而且滤饼含水量高。方法3、方法4的处理效果基本相同，但考虑到方法3的滤液由于含有黄血盐等
表3 絮凝方法工业化试验结果

项目 方法1
9602018批 方法2
9602007批 方法3
9603001批 方法4
9602025批
放罐酶活力(u/ml) 28 466 30 428 29 214 29 018
絮凝后直接观察 稀、稍粘 稀、有粗颗粒 稀、有明显絮状物 同方法3
过滤液时间(h) 22 16 6 5
滤液酶活力(u/ml) 22 772 23 646 24 540 24 566
滤饼酶活力(u/g) 7 759 6 432 5 648 5 489
滤饼水分(％) 62 58 53 52
滤液颜色 棕红色、较亮 棕红色、亮 浅棕红色、亮 浅棕红透亮
得滤液体积(m3) 5.2 6.2 5.7 5.7
得成品体积(m3) 1.00 1.10 1.21 1.20
成品酶活力(u/ml) 104 170 106 437 105 448 104 766
成品感官鉴别 褐色、粘度大 棕色、稍粘 棕色、稍粘 棕色、稍粘

化合物，可能对成品质量有影响，因而我们选用方法4进行生产。
在絮凝处理的试验研究和工艺操作中，我们的经验是：
(1)絮凝剂的使用效果与多种因素有关，其中最重要的是絮凝剂的浓度，搅拌转速和搅拌时间。
(2)絮凝剂的添加量从零开始增加时，被絮凝的悬浮粒子的量相应增加，但超过一定浓度后，已絮凝的粒子又发生分散。因此，要通过试验确定絮凝剂的最佳添加量。
(3)添加的絮凝剂与悬浮液中的粒子接触是发生絮凝的前提条件，因此需要进行搅拌。但是，生成的絮凝物是很脆弱的，过分的搅拌会使絮状物破碎倾向大于生成倾向，因此，又必须控制搅拌转速和时间。我们根据实际生产情况，采用了搅拌30 min，转速50～80 r/min的操作，取得了良好的絮凝结果。
2.5 板框过滤工序的工艺操作
液体酶的生产，需要的是滤液,因此，滤液的清浊直接影响液体酶的品质及超滤设备的使用。开始进料时，由于滤布比较干净，应靠罐内的压差自然进料。如果一开始就加压进料，会造成滤液的浑浊。待一段时间，当滤液很清，且滤速恒定时，缓缓加压进料。在此特别强调，板框的接收槽的放液口要有一个使浑浊液重回絮凝罐的装置，一旦发现滤液浑浊，便能及时打回。每批滤完后，要把滤布洗净，安放整齐，以待下次再用。
板框过滤出的滤饼，各厂家应根据实际情况进行处理。我们厂由于还生产固体酶，在其生产过程中，需要一部分填充料进行标准化处理,因此，我们将滤饼烘干处理后做填料。烘干物还有2万余单位的酶活力，这样处理比较理想。
2.6 超滤浓缩工艺的研究
超滤是加压膜过滤方法的一种，其工作原理是在一定压力下，把大溶质分子阻留在膜的一侧(留在原来溶液中)；而小溶质分子透过至膜的另一侧，从而达到分离纯化、浓缩产物的目的。超滤法适用于生物大分子发酵产品(如糖化酶、α－淀粉酶)等的提取纯化和浓缩。该工艺具有成本低、操作方便、条件温和、较好地保持酶活力、产品回收率高等优点。
我们选用了进口UF809型卷式超滤膜，并根据产品质量和工艺要求，采用了每组3支、3组并联的形式安装超滤机。超滤器的进口压力为4×9.8×104 Pa左右，出口压力2～4×9.8×104 Pa左右，进出料口之压差以1×9.8×104 Pa左右为宜。操作温度在40℃以下。酶液的浓缩倍数根据需要而定，一般在4～5倍左右。运行过程中定时测定超滤液的流量及酶活力，以确认超滤器运行是否正常。超滤浓缩结果见表4。
表4 超滤浓缩统计结果

批

号 发酵液
酶活力
(u/ml) 取发酵
液体积
(m3) 滤液
体积
(m3) 超滤
时间
(h) 超 滤 浓 缩 结 果 对发
酵液
收率
(%)
成品酶
活力
(u/ml) 成品
体积
(m3) 浓缩
倍数
(v/v) 浓缩
倍数
(u/u) 酶活力
收率
(%)
9507-01 29 871 8 5.8 2.5 120 301 1.54 3.76 4.00 98 77.5
9507-02 27 232 8 6.0 2.3 110 380 1.50 4.00 4.05 97 76.0
9503-04 28 431 8 6.1 2.2 115 182 1.56 3.80 4.05 97 79.0
9508-10 30 781 8 5.5 2.0 123 124 1.60 3.44 4.00 98 80.0
9509-07 31 232 8 6.0 2.1 128 429 1.50 4.00 4.10 99 77.0
9509-09 30 231 8 5.9 2.0 111 718 1.60 3.70 3.75 98 75.0

从表4可看出，每处理8t左右清液所需时间基本在2.3 h左右，浓缩酶总收率在75％以上。
2.7 精制浓缩液体酶的保存实验
将浓缩酶(10万u/ml)加入适量的防腐剂,于常温保存3个月后，测定酶活残存率，其结果见表5。
表5 精制浓缩液体酶的保存实验

添加防腐剂量(％) 残存酶活力(％)
不 加 一星期后出现霉变、有恶臭味
醋酸钙0.1、青霉素180万单位/m3 97
苯甲酸钠0.2、青霉素180万单位/m3 96
苯甲酸钠0.2、山梨酸钾0.1 98

由表5可知，3个月酶活力保存率均高于95％。由山梨酸钾和苯甲酸钠组成的防腐剂，酶活残存率为98%，为上述3种防腐剂中最理想的，适合工业化生产。
作者单位：曾 辉 何新民 张新武 三门峡发酵厂，卢氏，472200
刘仲敏 河南省科学院生物研究所，郑州，450008

参考文献

[1] 张树政主编.酶制剂工业.北京:科学出版社,1984
[2] 曹友声、刘仲敏主编.现代工业微生物学.长沙:湖南科学技术出版社，1998