土壤微生物分离纯化及测数
一、实验目的要求
1 了解土壤微生物的分离纯化及测数的基本原理。
2 学习并掌握微生物分离纯化技术方法。
3 学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。
二、基本原理
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。
三、实验步骤
（一）土壤样品采集
在待测田块上，若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样，若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。
（二）好气性细菌的分离纯化及测数
1.制备土样稀释液
吹吸三次混匀
无菌操作
另留一管不稀释留作对照（CK）
2.培养基的准备
融化牛肉膏蛋白胨培养基，融化后保温在48℃。并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10-5、10-6、CK（每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿）。
3.倾注法接种
先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基（48℃）待冷凝，混合均匀。
4.保温培养
将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日（30℃），观察结果。
5.分区划线法纯化
平板划线分离，其划线方法有以下两种：
6.计数
要求30~300之间计数。CK除外。
每克湿土样细菌数量
＝平均菌落数×稀释倍数
土壤样品水分系数
＝1∕（1—样品水分百分数）
土壤样品细菌数量（个∕克干土）
＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数
四实验报告及思考题
1记录计数结果并计算土壤样品含菌数。
2平板菌落计数的结果是土壤样品实际含菌数？
3 比较平板菌落计数与显微镜直接计数的异同，它们各有何优缺点
评价方式
既要重视终结性评价如实验操作考试、书面考试、面试等，更要重视形成性评价如实验作品,实验报告、课题研究报告、研究小论文、提问、交谈等，观察记录学生主动参与教学过程或课题研究活动的程度，对学生的综合能力进行阶段性评价，并注意指导学生进行自我评价。
本模块教学不应只追求实验结果和技能本身，而应重视尝试或制作实践,如“土壤微生物分离纯化及测数”，不仅仅看学生是否制作成功，更要关注制作中学生探究能力的发展,重视学生实践活动中全过程的评价，如，能否搜集资料确定实验方案，能否按照实验操作规范要求安全完成实验，能否实事求是记录和搜集实验数据，能否在实验中与他人合作与交流等方面。
对实验操作技能的评价可利用实验操作检核表等工具。利用检核表评价操作行为时，要依次列出需要检核的项目及操作行为要点，然后，观察被检核者是否表现了这种行为，并予以记录。检核表的制作应以实验步骤和操作要求为依据。
参考资料：http://2009.cersp.com/article/browse/3697203.jspx