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实时荧光定量pcr引物怎么设计
如题所述
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推荐答案 2017-11-03
1、查找该物种或近缘物种信息,看是否能确定内含子序列的位置,在CDS上设计跨内含子的引物,以避免基因组污染;
2、扩增片段大小最好在200bp左右,太大会影响扩增效率;
3、最好一次分别设计两条上游(距离较近)和下游引物(距离较近),组合成4个扩增片段;
4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量cDNA样本来验证引物扩增效果:主要是有无二聚体?有无非特异性扩增?
5、筛选出一对最满意的引物上机,祝你实验顺利。
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中两种
引物
的
设计
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10.引物3′端要避开密码子的第3位
.11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况.12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区.14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70...
如何设计荧光定量PCR的引物
及TaqMan探针
答:
2,
引物
末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。3,将引物尽量接近于探针 d循环参数 当引物和探针按照上述原则
设计
好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃60秒,对于一些模板,45秒也足够了。数据在退火时检测。e)怎么优化探...
做
PCR
达人,从
引物设计
开始
答:
对于
荧光定量PCR
这样的高级应用,
设计
要求更为严格:cDNA特异性与长度控制:</选择无重复碱基、Tm值在58-60℃的
引物
,产物长度保持在80-150 bp,跨越外显子,确保精确定量。TaqMan探针的设计艺术:</探针应靠近引物,长度在18-40 bp,GC含量40-80%,避免连续G,5'端通常排除G的使用,以保证信号的准...
实时荧光定量PCR
中两种
引物
的
设计
有什么要求
答:
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定(GC含量多),而3'端不稳定(AT含量多)的引物
,这种引物的结构可以有效地消除假引发反应;12、引物和产物之间的Tm值相差别太大,20摄氏度范围内最好。13、对引物的修饰一般在5'端进行,例如加酶切位点,加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。
最全
PCR引物设计
和PCR细节
答:
PCR设计
要点:</3'端避免连续G/C,无二级结构,避免终止在密码子第三位,
引物
浓度1-3μM,参考密码子表。引物间无互补,不超过4个连续同源碱基,保证结构稳定性。5'端添加标记、酶切位点和保护碱基,注意不影响特异性,Tm值计算时忽略附加序列。亚克隆策略:A.6bp酶切位点配以保护碱基;B.定向...
实时定量PCR引物设计
答:
1,
PCR引物
是利用碱基互补原则,通过找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。2,首先要找到你用来
设计引物
的目的基因全序列,一般NCBI、Genebank上都能找得到。3,引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导 致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合...
普通pcr引物设计和
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的区别
答:
1、普通pcr引物设计:为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。2、
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