全长cDNA PCR

Question

已知cds序列的开头20bp左右作为forward primer, 结尾的20bp左右互补序列作为reverse primer,Tm值相差不超过5度。用total RNA 的 T7 RT cDNA作为模版，准备扩增全长cDNA序列，但是总是p不出产物来，是什么原因呢？
我p的是全长cDNA, 引物就是开头和结尾的20bp左右序列。按照TM和CG调整的长度。
产物用来做gateway的，所以不可以凝胶提纯。
做过gateway的高手来啊，我再加50分了。

5'UTR大概300多bp,3'有1000多bp,应该不算短吧。
还有我是分2步加上那个重组段的,第一次pcr的结果只有一条带，然后用第一次的产物做第2次的pcr
既然第一次只有一条带，说明没有不同剪接本阿。第二次的结果却有拖带。。。

不过既然凝胶提纯没有问题的话，我也试试看吧，我们实验室用的是promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up system,不知道可以用不？

Answer 1

这是由于引物的特异性不行！

因为你的cDNA为600nt，加上200nt的poly（A），正好800nt。
但是由于特异性不好，引物结合位点可能是600到800范围内，所以会出现拖带！
这也解释了比我产物还要大的会是什么这个问题。

所以你还是重新设计引物吧。

另外，可以使用凝胶提纯，具体方法就不好多说了，请给我分吧，谢谢。

Answer 2

首先保证你的cDNA的质量。你的基因5'UTR和3'UTR多长？如果5'UTR过短导致你的CDS起始密码子过于靠近cDNA5'端，那么即使少量的降解也会大大降低你的扩增效率。

其次，如果你保证了cDNA的质量，那么产生的过大条带可能是不同的剪接本。你应该详细检查你的序列是否存在具有多个剪接本的可能。

还有，我怎么没听说过gateway载体不能用凝胶回收的？很多实验室都是胶回收后连接gateway载体的，只不过洗脱的时候用dd水洗脱就行了。本回答被提问者和网友采纳

Answer 3

如果目标基因太长（大于1KB），可能由于反转录的过程中反转录酶效率问题，没有反转录到全长mRNA。

Answer 4

1.用随机引物获取cDNA,(mRNA太长的话oligo dT 很难获得全长mRNA 的
cDNA)
2.如果片段较短，直接用你的引物克隆
3.如果cDNA很长，建议分段克隆，然后再将个片段通过overlap PCR法连接，

Answer 5

1.用随机引物获取cDNA,(mRNA太长的话oligo dT 很难获得全长mRNA 的
cDNA)
2.如果片段较短，直接用你的引物克隆