宋徽宗大观二年(公元1108年)，命四川名医唐慎微对《本草》加以修改、增补，史称《证类本草》。该书收藏药物1558种，附药方3000余个。人们一直对这本书推崇备至。
李时珍对《神农本草经集注》、《唐本草》及《证类本草》等药物学方面的巨著都一一进行了认真仔细的阅读和研究。一方面他敬慕前人的研究成果；另一方面也发现了这些著作中还存在一些理论上和观察上的错误，有必要加以整理和纠正。
再则，从宋代修订《证类本草》到李时珍生活的明代，历史又前进了500多年。外药的输入，加上金元以来药物学方面诸种流派之间的争论使医药理论得到较大的提高。再者，民间惯用药方的遗失也必将尽快补上。所有这一切都需要加以整理，写入新的药著之中，这个重担就落在了李时珍肩上。
基于以上的认识，年仅二十几岁的李时珍立志把旧的药书加以整理、补充、写出一部分类更加详细的药物学著作。但他心中十分清楚，要重新修订《本草》，力求在前人的基础上有所突破和发展并非易事。为此，他开始了长达数十年的准备工作。
为了继承前人的科学成果，李时珍查阅了浩如烟海的历史典籍、医学名著和各种《本草》。除了仔细精读各朝《本草》外，李时珍还广泛阅读了各种医著、方书等，如《黄帝内经·素问》、《黄帝内经·灵枢》、《张仲景伤寒论》、《扁鹊方》、《华佗方》、《张仲景金匮五函方》、《唐玄宗开元广济方》、《天宝单方图》、《宋太宗太平圣惠方》等二百七十七家。并对这些著作中的内容进行了审查、核对、分析、判断。在大量阅读医药典籍的同时，李时珍还翻阅了许多古今经史和稗官小说。
大约在1556年(明嘉靖三十五年)，礼部命令各地举选医学人才集中到北京，以补充太医院的缺额。湖广保送了一批著名的医生，李时珍也是其中之一。
李时珍到了北京后，虽然没有得到统治者的重用，但太医院丰富的藏书，来自海内外的各种药物，使他获益匪浅。他还多次到药王庙仔细辨识铜人模型的人身腧穴，熟悉了人体所有的腧穴及各经络的理路，为他撰写《奇经八脉考》等书打下了基础。太医院的寿药房、御药库也是李时珍经常光顾的地方，在那里他对来自不同地区的各种药物一一加以比较研究，积累了辨识药物的丰富经验。
李时珍在太医院时，几次向朝廷申奏要求支持他编修《本草纲目》一书，但都如泥牛沉海毫无反应。于是他托疾辞去了太医院的职务，踏上了南归的道路，决心自己独立完成编纂《本草纲目》的工作。
编纂一本规模宏大的药物学著作单有丰富的理论知识是远远不够的。当撰写工作开始时，李时珍把搜集到的材料按自己制定的分类方法，逐条进行编写，但随着研究的深入，他感到困难越来越多，最使他感到茫然的是许多药物的形状和生长情况在古人的书籍里往往模糊不清，有的甚至互相矛盾。经过一番苦思冥想，李时珍终于认识到，要解决这些问题，惟一的途径是深入民间，采制标本，搞实物考察。
李时珍的足迹踏遍了蕲春一带的山山水水，近的如缺齿山、远的如丫头山、大的如紫云洞、小的如朱家洞，都成了他奔走访问的对象。他对山中的甘菊、苦参、紫苏、苍耳……及土蜂、蟾蜍、竹难、野猪等都进行了仔细的观察和研究。
为了采制有价值的标本，彻底弄清楚古人所述的各类药物，李时珍到过武当山采药，也去过盛产药材的摄山、茅山、牛首山等地。他登山梁，下河谷，踏原野，去水乡，足迹遍布湖广、江西、江苏、安徽等省。
在寻访四方的过程中，李时珍交了一大批民间朋友，并从他们那儿得到了许多书本上学不来的知识。他遇农民，便问五谷的生态和属性；逢渔夫，就打听鱼虾鳖蟹的捕捉和食用；见到猎人，则询问野兽飞禽的生活习性和药用价值；碰到樵夫，便聊起植物的形态与采摘季节；向药农请教药材的采集和泡制；向果农了解瓜果的种植嫁接和品种滋味。通过广泛的请教和亲身实地考察，李时珍纠正了许多前人的错误观点。
为彻底弄清药物的功效，李时珍常以身试药，有几次甚至差点中毒身亡。