示例结果可以看: https://www.dropbox.com/s/sn8drmjj2tar4xs/ChIPQCreport - full dataset.zip?dl=1
首先映入眼帘的是总体报告:
其中有一些指标见过,一些没见过,像是SSD, RiP and RiBL这几列就是ENCODE计划提出的指标。就是评估了信号的分布,在富集区域、整个基因组、已知的artefact regions
总而言之,这些全部的指标可以分为4类:
切记:通过这些指标也不意味着实验就是成功的,相反亦然
包括了:read depth, read length, duplication rate
如果read depth, read length在样本间差异很大,就要引起注意了
由于之前已经过滤掉了重复reads,所以这里的duplication rate没什么用
包括了RiP, SSD, and RiBL
也叫FRiP,表示:the percentage of reads that overlap ‘called peaks’,也就是peaks包含的reads数占reads总数的百分比
可以理解成:信噪比(signal-to-noise)
根据感兴趣蛋白(POI,protein of interest)的不同,RiP值也差异较大:
上面图中看到,Nanog比Pou5f1的RiP值要高,而Pou5f1-rep2更是低的可怜,可以说明的是:Nanog样本富集效果更好
有两张图可以反映:
不过看箱线图发现,虽然Nanog的RiP较高,但这个分布和Pou5f1也相差太远,推测可能与read length 、 depth有关
表示基因组中信号值的标准差,可以反映reads在基因组中覆盖度一致性,越大越离散,就是高的越高,低的越低
我们希望看到:IP样本中这个值较大,说明富集区域信号很强 ,非富集区域信号较弱,因此它的标准差很大;而control样本最好就是标准差较小,不要有太大的波动
SSD值高虽然说明有的区域信号强,但不一定是ChIP的富集区域,一些blacklist区域也会存在较强的信号
【关于blacklist:】
我们这里的数据显示:Pou5f1比Nanog的SSD值要高,可能说明Pou5f1的富集效果更好,但不能确定,因为还需要确定Pou5f1的SSD高不是由于未知的artifact造成
有一张图可以反映:Coverage histogram
好的富集结果一般是:有一条尾巴(依然存在很多位点具有较高的测序深度);而像input样本这种低富集的,主要是包含背景,因此它的y轴很高,同时x轴很低
我们这个数据集中,尤其是 Nanog rep2样本,具有更粗壮的尾巴(Heavy tail,意思就是在曲线以下具有更大的空间) 。Nanog样本具有更多高深度的位点
综合考量:
Pou5f1的coverage不如Nanog,但SSD高于Nanog。说明Pou5f1存在某一块区域深度较高,但不是整体都高,可能存在blacklist区域
那么是否真的存在blacklist区域呢?还有再看一个指标:
也就是与已知blacklist有交集的reads占比。这个值越低越好
黑名单区域一般也是唯一比对,因此常规的去重复操作对它无效。这些区域一般是:着丝粒,端粒和卫星重复序列
黑名单区域的危害是:confound peak callers and fragment length estimation,因此需要追踪并去除比对到这些区域的reads
我们的数据中,RiBL的比例看上去还比较合理,并没有出奇的高。因此高SSD可能是因为存在更多容易破碎的开放染色质区域,或者存在hyper-ChIPable区域,与很多不相干的蛋白也能产生富集,导致假阳性
当然,如果 在peak calling之前去掉了黑名单区域,就没必须分析RiBL了
主要包括:FragLength and RelCC(又称Relative strand cross-correlation coefficient or RSC)
一般,RelCC在所有的ChIP样本中大于1,表示具有较高的信噪比;FragLength也应该与文库制备过程中设定的片段长度接近
一个高质量的ChIP实验,会在POI附近形成非常显著的reads富集,会在正负链发现双峰分布
Cross-Correlation scores的计算:Pearson’s linear correlation between coverage for each complementary base. These Pearson correlation values are computed for every peak for each chromosome and values are multiplied by a scaling factor and then summed across all chromosomes,就是先在正负链生成两个向量,表示某个碱基位点的reads数量,然后求这两个向量的相关性,并逐渐沿着shift size移动,最后得到一个相关性表
最后这个cross-correlation值算好,就会画在y轴上,x轴就表示shift size
<img src="https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-06-20-120928.png" alt="image-20200620200928712" />
一般这个cross-correlation plot会产生两个峰:
我们这里的数据中,Nanog 和 Pou5f1都能看到两个峰:
它就是根据cross-correlation的最大、最小值计算的
RSC值低可能是由于ChIP的质量差、测序reads质量差导致错配多、测序深度不够【其实可以理解为:RSC值低=》就是相关性计算的值低=》正负链没有足够的reads =》 也就是上述原因】
另外,数据集的结合位点太少(比如小于200)也会导致低的RSC【这个也很好理解,结合位点少,更别提位点正负链富集的reads数量了】。结合位点少的原因可能是生物因素(比如某一个因子在某一个特定组织中就这么几个位点)
Cross-Correlation Plots的例子
强信号:
下面这个例子是人类细胞的CTCF 转录因子(zinc-finger transcription factor)。使用一个好的抗体,转录因子一般会富集45,000 - 60,000个peaks。红线表示真正的peak,蓝色线表示read length
弱信号:
抗体不是特别有效,得到的峰也比较分散,在185-200bp间存在真的峰,另一个蓝色则是read length。对于弱信号的数据,read-length peak将占据主导地位
没有信号:
表示实验失败或者input样本,基本看不到fragment length这个峰
也就是在特定的结合位点附近,没有富集到reads
将peaks与基因组注释结合起来,看看reads主要富集在哪些区域
我们的数据中,“Promoters500” and “All5UTRs”的富集程度最高,也符合预期(Nanog和Pou5f1作为转录因子应该结合在这块区域)
这个形状根据抗体的类型存在差异:transcription factor, histone mark, or other DNA-binding protein such as a polymerase