三质粒转293t构建慢病毒需要消化细胞吗

如题所述

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第1个回答 2017-09-07

含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化，提取慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。5）分装、-80℃保存。6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

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病毒转染原理及步骤答：在实验中，慢病毒载体的构建与包装需要精心操作。例如，设计特定的PCR引物，构建过表达或干扰质粒。然后，将这些载体与辅助质粒共转染293T细胞，收集并浓缩病毒上清液，用于细胞转染。无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，都有特定的转染方法，如使用polybrene增强病毒与细胞的结合。值得注意的是，北京英格恩生物公司的...

转染293t多长时间能产生慢病毒答：一般认为，在转染后的第24~48 h之间，是慢病毒的生产高峰，这时病毒产生速率高于降解速率。可以在这个时间收获第一批慢病毒，此时也是滴度最高的时候。在随后的 48~72 h中，包装依然持续进行，但滴度下降（生产能力下降，但降解速率不变）。从产量角度而言，在这24 h内，可以使用小体积的培养基收获1~...

293细胞培养消化到什么程度为好答：293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型。细胞（英文名：cell）并没有统一的定义，比较普遍的提法是：细胞是生物体基本的结构和功能单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体现。1. 养293细胞和293T一样。以293T为例，预先准备3...

如何养293、293T系列的细胞?答：混匀，不能吹打，分装2瓶。如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min。

293细胞形态特点答：早期研究曾认为细胞含有Ad 5基因组的两端，但现已明确只包含左端序列。这个细胞系的人腺病毒滴度较高。在培养过程中，293细胞的传代方法包括消化、洗涤和接种到新培养皿，而293T细胞则生长快速，需定期稀释并更换培养基以保持良好的细胞健康。细胞的冻存处理需使用特定的培养基配方，如ATCC培养基，其中...

如何生产高滴度的慢病毒答：效率，还要看细胞毒性。事实上，状态好代数低的293T细胞都很容易转染，因此，在慢病毒包装的转染实验中，我们应该更多地去关注细胞毒性问题。正因如此，有不少方案推荐使用磷酸钙转染法。但磷酸钙转染法操作繁琐，对 pH 的要求甚高，转染效率稳定性差。3.插入基因片段的大小慢病毒载体容纳外源基因...

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(5)293FT细胞转染验证 and trouble shoot...答：（1）sgRNA+pSpCas9载体用lipofectamine 3000转染至293FT细胞（按照转染试剂的说明书走），确保转染效率> 70%；（2）72 h后收集细胞提取基因组DNA（按照基因组DNA提取试剂盒的说明书操作）；（3）使用事先设计好的引物进行PCR扩增，这里使用的酶是NEB公司的Q5 high-fidelity Polymerase，一切按...

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